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清肺口服液治療小兒呼吸道合胞病毒性肺炎的分子機理研究
發布日期:2012年12月26日

一、主要技術內容
     完成霍英東教育基金會 “金欣口服液抗RSV感染黏附、融合、復制及干擾素調控機理研究”(111042)、高等學校博士點基金“清肺口服液對呼吸道合胞病毒相關基因調控的研究”等課題,從細胞、蛋白、基因的不同層次,病毒感染后細胞凋亡及病毒感染進程各環節,闡明了清肺口服液抗呼吸道合胞病毒(RSV)的療效機理。研究表明:清肺口服液抗RSV主要機理,不在于直接抑制RSV增殖,而是影響RSV生命周期,抑制RSV與細胞的膜融合,同時調節機體免疫及組織細胞功能。
    建立RSV體外細胞感染模型,采用直接和間接抗RSV活性法比較細胞存活率、細胞病變抑制率,采用病毒滴度測定方法觀察RSV滴度變化,研究清肺口服液對RSV的拮抗作用,結果表明含清肺口服液血清有直接殺傷RSV的作用,并間接作用于靶細胞上,阻斷其與RSV的吸附或融合,對感染RSV的Hep-2具有保護作用。
    采用透射電子顯微鏡成像技術觀察RSV感染細胞超微結構,發現清肺口服液含藥血清可以減輕RSV感染后細胞核增大,核質比增加,核仁凝聚,核膜凹陷成夾層,包涵體形成,線粒體凝聚等病變。
    采用流式細胞儀分析細胞總凋亡率及早期凋亡率以及凋亡相關蛋白Fas與FasL、Bcl-2與Bax的表達,以RealTime-PCR法檢測Bcl-2、Bax mRNA的表達。發現清肺口服液含藥血清早期可通過調控Bcl-2、Bax的表達阻止RSV抑制凋亡,晚期可通過抑制Fas、FasL基因過量表達而拮抗RSV引起的過度凋亡。
    采用RealTime-PCR及ELISA法測定各組人胚肺成纖維細胞(HELF)IFN-βmRNA表達水平及上清液中IFN-β的含量,結果提示體外細胞水平上,RSV不刺激HELF生成IFN-β,清肺口服液也不誘生IFN-β。建立RSV感染的大鼠肺炎模型,獲取動物血清,研究清肺口服液對相關細胞因子的影響,發現在動物整體水平清肺口服液可誘導RSV感染宿主體內IFN-Ⅰ,調節TNF-α及IL-10等細胞因子而達到間接抗病毒作用。
    建立病毒體內外感染模型,采用免疫熒光結合激光掃描共聚焦顯微技術、體外轉錄、RealTime-PCR、ELISA 等技術,研究清肺口服液對RSV感染生命周期影響及分子機制。結果表明清肺口服液可通過抑制F蛋白表達,阻止病毒與細胞、細胞與細胞的膜融合;抑制RSV感染細胞的增殖,推遲或減輕細胞病變;拮抗RSV引起的細胞內鈣離子超載及活性氧異常升高,維持鈣離子內環境穩定、保護線粒體、改善能量代謝;調節ICAM-1表達,緩解RSV感染后細胞的異常變化。
二、授權專利情況
    國家發明專利《一種治療小兒病毒性肺炎的清肺口服液制劑及其制備方法》(專利號ZL03131642.5)。
三、技術經濟指標
    專家組“鑒定意見”認為“課題組……在基因水平上探討了該藥的作用機理,……研究工作達到了小兒病毒性肺炎中醫藥研究的國際領先水平”。
四、應用推廣及效益情況
    藥品用于臨床治療患兒已有10萬人次以上。僅近五年就新增收入312萬元;《藥品臨床研究批件》《發明專利證書》獲轉讓費170萬元。

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